“博观而约取，厚积而薄发”
─ 病原微生物宏基因组检测剖析和未来展望
传统病原体鉴定方法和优缺点分析
微生物鉴定方法分为培养和非培养两类，临床公认的金标准是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。以结核分枝杆菌为例，它是引起结核病的病原菌，每年在全球造成1000万开放性患者。但由于细胞壁中富含脂质，影响营养物质的吸收，结核分枝杆菌的生长缓慢，通常需要4-6周才能确诊。相比之下，不依赖培养的方法比如涂片镜检、抗体抗原免疫等，在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强，但在准确性上存在较明显的劣势。比如镜检是通过形态学、染色性等生化性质鉴定微生物，只能进行粗筛，无法细分。而免疫类方法借助荧光、酶联免疫ELISA、化学发光等方法鉴定微生物，敏感性和特异性较差。
近年来，基于核酸检测的分子诊断技术发展迅速。核酸是携带和传递生物体遗传信息的大分子，几乎所有的病原体都含有核酸（DNA或RNA），而且核酸序列具有显著的物种特异性。因此，对感染患者样本中的核酸进行检测可以准确反应病原微生物的种类和含量。1985年，Mullis等人发明了聚合酶链式反应（PCR），它使得微量核酸可以在短时间内被指数级扩增 [3]。因为敏感性高、特异性好的优点，基于PCR的核酸检测被广泛应用在病原体诊断领域。通过对靶标微生物核酸进行提取、富集和检测，可以一次鉴定一种或十几种病原体，非常适合用于常见病原体的筛查。以社区获得性肺炎（community acquired pneumonia, CAP）为例，数十种细菌和病毒就可以解释绝大部分临床病例，包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎支原体、鼻病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等[4]。
病原微生物宏基因组测序
在急危重症感染中，患者往往因为遗传性疾病、肿瘤、营养不良、器官移植、药物等因素导致免疫缺陷（immunodeficiency），除了遭受普通感染外，尤其容易受到机会性感染（opportunistic infection），即条件致病菌引起的感染。条件致病菌在环境和人体中常见，比如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），在免疫功能正常的人群中不致病，但在宿主免疫功能缺陷时入侵宿主细胞。这类感染涉及的微生物种类复杂，不能根据经验提前预判（已知的致病性微生物超过10000种），常规检测方法无法覆盖。相比之下，宏基因组测序（metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS）直接对样本中的核酸进行“鸟枪法（shotgun）”大规模平行测序，得到的序列信息与已知微生物数据库比对分析，判断样本中微生物的种类和含量。理论上，mNGS可以报告所有已知基因组序列的病原体，为危重和疑难感染患者的临床诊断提供了行之有效的技术手段。Blauwkamp等人2019年的一项研究显示，在350名败血症患者中，mNGS的检测结果与金标准“血培养”相比，一致性达到了93.7%。在166份样本中，传统检测方法（培养、血清免疫学、PCR）均显示阴性结果，但mNGS在其中的62份样本中发现病原微生物，显示了这一方法在检出率和准确性上的巨大优势 [5]。Parize等人发现mNGS对免疫抑制宿主感染的病原体诊断具有重要的参考价值，在病毒和细菌诊断上mNGS 阳性率高于传统方法3倍以上，同时具有更高的阴性预测值 [6]。除了病原体覆盖广、准确性高，mNGS还可以获取耐药突变信息和毒力基因。因为抗生素滥用，超级细菌（superbug）已经成为健康卫生事业中的一大难题。超级细菌泛指对多种抗生素具有耐药性的细菌，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和多重耐药性结核分枝杆菌（MDR-TB）等。高覆盖度的mNGS可以评估病原体的药物敏感性，精准指导临床用药 [7]。
正是凭借上述优点，mNGS被越来越多的临床医生认可和使用，相关的技术标准和临床指南也层出不穷：2016年，美国药监局（FDA）发布mNGS体外诊断产品指南草案；2018年，mNGS被写入中国成人院内感染肺炎（HAP）和呼吸机相关肺炎（VAP）诊断和治疗指南。同年，mNGS被提议用于儿童呼吸道细菌和病毒感染诊断；2019年，mNGS在急危重症感染应用的首个专家共识发布。
mNGS临床应用需解决的问题
任何一项技术都存在利弊，mNGS也不例外。在开展病原微生物宏基因组检测之前，从业者需要认真思考以下几个问题并提出切实可行的解决方案：
01
时效性
mNGS需要对不同类型的临床样本进行预处理，操作步骤包括但不限于：核酸提取、文库制备、纯化、定量、上机前质控、pooling等。再加上测序反应和数据分析，整体流程复杂、耗时长，自动化程度低。核酸在扩增后有可能产生气溶胶污染，而大多数文库制备方法包含PCR扩增步骤，因此实验室在防止污染和质量控制上需要建立一系列标准化SOP。由于技术本身的复杂性，目前mNGS多以送检服务为主，样本周转时间（TAT）一般为72小时。而对危重感染患者而言，时间就是生命。如何进一步缩短TAT，尽快汇报检测结果，是亟需解决的问题之一。
02
准确性
mNGS可以覆盖10000种以上病原体，检测灵敏度很高。这是把双刃剑，在实际临床取样、运输、样本处理、上机测序等环节中都有可能受到环境、容器、试剂中的微生物核酸污染。另一方面，人体含有定植性的微生物（不同个体、不同样本类型，定植微生物的种类和丰度有较大差异）。这些因素都会导致mNGS结果中含有大量非致病性微生物，而真实的病原体则隐藏在定植和背景微生物中。因此，如何结合样本类型、实验对照和临床信息来准确判断病原体，是必须攻克的难题。
03
检测DNA or DNA+RNA？
众所周知，一些病毒的基因组为RNA，用DNA建库的方法不能检出。此外，RNA与DNA的测序结果可以互为确认和补充。同时，RNA丰度与基因转录活跃程度正相关，检测RNA可以识别死菌和活菌，区分现行和既往感染。因此，DNA+RNA测序与DNA测序相比具有多重优势，尤其在儿童感染中有很大需求，但人源RNA比DNA有更高的丰度和复杂度，且RNA易降解，对样本运输和保存有更高的要求。如何稳定有效地实现DNA和RNA同时检测，是提升mNGS临床检出率和准确性的保障之一。
展望：更快、更准、更智能
高通量测序和庞大的微生物基因组数据库赋予了mNGS无与伦比的病原体覆盖广度。从上文的分析中不难推断，这项技术必然朝着“更快、更准、更智能”的方向发展。
为了达到这些目标，从业者们从不同的方向做出了各自的努力。以杰毅生物PDC-seq™病原微生物宏基因组检测为例，它在仪器、试剂和软件三个维度同时做出了创新：仪器方面，使用了自动化文库制备仪进行样本处理和建库，可做到样本进，文库出，同时杜绝了PCR扩增造成的气溶胶污染；在试剂方面，可以同时检测DNA和RNA，每份样本引入内参，每批样本引入阴性质控和环境质控，最大程度控制污染；在软件方面，使用智能化分析软件对测序结果进行处理并出具临床报告。通过自然语言处理和基于临床大样本的机器学习构建知识图谱，建立患者症状、用药、病史等多层次信息与病原体之间的相关性和因果性，识别定植/背景微生物，提高检测报告对临床医师的参考价值。
mNGS是一项潜力巨大的检测技术，随着测序平台、实验操作、数据分析流程的完善和临床研究的深入，mNGS必定会为急危重症和疑难感染患者提供精准的病原体诊断依据，辅助临床医师在第一时间了解病因，制定治疗方案，挽救患者的生命。
参考文献
1. Handelsman, J., et al., Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chem Biol, 1998. 5(10): p. R245-9.
2. Wilson, M.R., et al., Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med, 2014. 370(25): p. 2408-17.
3. Mullis, K., et al., Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1986. 51 Pt 1: p. 263-73.
4. Leber, A.L., et al., Multicenter Evaluation of BioFire FilmArray Respiratory Panel 2 for Detection of Viruses and Bacteria in Nasopharyngeal Swab Samples. J Clin Microbiol, 2018. 56(6).
5. Blauwkamp, T.A., et al., Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nat Microbiol, 2019. 4(4): p. 663-674.
6. Parize, P., et al., Untargeted next-generation sequencing-based first-line diagnosis of infection in immunocompromised adults: a multicentre, blinded, prospective study. Clin Microbiol Infect, 2017. 23(8): p. 574 e1-574 e6.
7. Sahoo, M.K., et al., Detection of cytomegalovirus drug resistance mutations by next-generation sequencing. J Clin Microbiol, 2013. 51(11): p. 3700-10.
